——大規(guī)模細胞培養(yǎng)——
細胞工廠升級劇集片
上期說到，耐思細胞工廠是一種設(shè)計精巧的細胞培養(yǎng)裝置， 可用于如細胞與基因治療、疫苗或干細胞領(lǐng)域等工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，適合于貼壁細胞培養(yǎng)，線性放大不會改變細胞生長的動力學(xué)條件。
細胞工廠在各行各業(yè)究竟起到了什么樣的作用呢？
細胞工廠應(yīng)用于哪個階段呢？
如何操作才能發(fā)揮細胞工廠的價值呢？
細胞工廠擴大化培養(yǎng)之操作手冊篇
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一、應(yīng)用方向
01
細胞與基因治療
細胞與基因治療是指載體治療，是一種將外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入靶細胞、修飾或操縱基因的表達、改變細胞的生物學(xué)特性，從而達到治療效果的新興治療方式。
如何將目的基因或者細胞安全有效地傳送到人體內(nèi)成為這一療法需要突破的重要瓶頸。一般需要借助病毒作為載體，如腺病毒、腺相關(guān)病毒以及慢病毒。
以研發(fā)為目的的小規(guī)模生產(chǎn)是采用生長在培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、細胞工廠的貼壁細胞。當轉(zhuǎn)向臨床實驗時會需要大量的慢病毒載體，這個時候就需要用到細胞工廠，一般10層細胞工廠應(yīng)用較多。
02
疫苗產(chǎn)業(yè)
疫苗在人類疾病防控中具有不可替代的作用，如何實現(xiàn)疫苗經(jīng)濟、高效且安全的大規(guī)模生產(chǎn)，一直是業(yè)內(nèi)考慮的重點。
隨著生物技術(shù)的持續(xù)創(chuàng)新發(fā)展，疫苗種類呈現(xiàn)多元化發(fā)展態(tài)勢，除了滅活疫苗、減毒活疫苗、重組蛋白疫苗等我們熟知的類型外，病毒載體疫苗、DNA疫苗、mRNA疫苗等新型疫苗陸續(xù)出現(xiàn)。
目前，細胞工廠已廣泛應(yīng)用于新冠疫苗、口服脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗[1]、凍干甲型肝炎減毒活疫苗[2]、麻腮風(fēng)疫苗[3]、口服輪狀病毒活疫苗[4]、水痘疫苗[5]等的工業(yè)化生產(chǎn)。
03
干細胞領(lǐng)域
干細胞是一類具有無限的或者永生的自我更新能力的細胞，能夠產(chǎn)生至少一種類型的、高度分化的子代細胞。根據(jù)美國臨床試驗數(shù)據(jù)庫clinicaltrials.gov顯示，目前全球與間充質(zhì)干細胞相關(guān)的臨床試驗有1300多項，已獲批上市的干細胞新藥14款。利用細胞工廠進行間充質(zhì)干細胞、多功能干細胞的工藝放大，是干細胞研究中的重要步驟。
二、操作手冊
01正確操作步驟
常規(guī)十層細胞工廠操作方法
1. 將準備好的培養(yǎng)基倒入細胞工廠。（建議每層加入的體積為150-200mL）
2. 將細胞工廠側(cè)放，使液面平衡。
3. 液口朝上，靜置后培養(yǎng)液平均分配到每一層。
4. 緩慢將細胞工廠放至水平位置。
5. 放入細胞培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。
帶管路十層細胞工廠操作方法
1.將進液管路上的軋帶剪掉。
2.根據(jù)需求可在進液管路上加上管夾，將進液管路末端和儲液瓶的出液管路通過無菌接管機進行連接。
3.加入細胞懸液，將進液管路上的管夾關(guān)閉。儲液瓶中的培養(yǎng)基或細胞懸液可利用重力虹吸原理或使用蠕動泵將細胞懸液加入到細胞工廠，操作過程中盡量避免產(chǎn)生氣泡。
4.將細胞工廠側(cè)放，使液面平均分配到每層，進液管路側(cè)朝下，空氣濾器側(cè)朝上，避免液體進入到空氣濾器中。
5.順時針旋轉(zhuǎn)90℃，使加液口朝上，靜置后液體平均分配到每一層。
6.緩慢將細胞工廠放至水平位置,整理好進液管路，然后放入細胞培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。
注意事項：
1.請?zhí)崆皩⒓毎S和培養(yǎng)基預(yù)熱至培養(yǎng)溫度∶由于大的培養(yǎng)器要達到設(shè)定的培養(yǎng)溫度需要很長時間，所以在實驗開始前，將細胞工廠和培養(yǎng)基預(yù)熱至培養(yǎng)溫度，可加快細胞貼壁，并顯著提高細胞回收率。
2.請緩慢操作，避免大幅晃動產(chǎn)生氣泡∶ 氣泡可能導(dǎo)致培養(yǎng)基從上層流到下層。
3.避免酒精噴灑到透氣蓋上，酒精可能會濕潤疏水濾膜，導(dǎo)致不能透氣影響氣體交換或?qū)е虏僮鲿r不能平衡壓力。
02觀察細胞方法
一般使用倒置顯微鏡對細胞工廠中細胞的存活率和生長狀況進行監(jiān)測。細胞工廠中各層之間或同一層之間的培養(yǎng)環(huán)境基本相同，因此可以通過觀察底部一兩層或同一層之間的邊緣細胞狀態(tài)，來判斷整體細胞工廠中細胞的狀態(tài)。
常規(guī)的倒置顯微鏡受制于上光源和載物臺之間的高度，一般只能用于1層、2層或5層細胞工廠的觀察；對于10層的細胞工廠，就需要增加上光源和載物臺之間的高度，使其可以適配細胞工廠的高度；對于更大的40層的細胞工廠，人手操作有困難，一般需要大型設(shè)備進行電動化、自動化的觀察。
03收獲細胞指南
1.培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)液倒出。
2.使用無鈣無鎂磷酸鹽緩沖液（CMF-PBS）清洗（40-50 mL/層），若有需要重復(fù)清洗一次。
3.消化∶消化液（10-40 mL/層）提前預(yù)熱。
4.收集∶ 1000 rpm 離心5分鐘，去除消化液，收集細胞。
5.清洗∶用CMF-PBS或培養(yǎng)基清洗消化過的培養(yǎng)器。
注意事項：
1.確保CMF-PBS完全浸過每層培養(yǎng)面，并輕輕前后晃動細胞工廠，將殘留的培養(yǎng)液清洗干凈。
2.消化液平均分布到每層，輕輕前后左右傾斜培養(yǎng)器，確保消化液完全浸過培養(yǎng)面，輕輕拍擊培養(yǎng)器幫助細胞從表面脫離。
3.對于細胞工廠，由于不能清晰觀察中間層的細胞消化狀態(tài)，建議參照完全相同培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)瓶或單層細胞工廠的消化狀態(tài)。亦可使用專用的多層細胞培養(yǎng)器觀察臺來觀察每層細胞的消化狀態(tài)。
4.若清洗液或者是細胞工廠培養(yǎng)層存在大量細胞，則需要清洗多次或調(diào)整細胞消化的操作。
5.培養(yǎng)溫度的一點點偏差都可能影響到細胞的收獲率，需密切關(guān)注培養(yǎng)的溫度是所設(shè)定的溫度。
