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腫瘤細胞轉(zhuǎn)移主要包括以下5個過程:
原位侵襲(Local invasion),
腫瘤細胞內(nèi)滲(Intravasation),
循環(huán)系統(tǒng)存活(Survival in the circulation),
腫瘤細胞外滲(Extravasation),
形成轉(zhuǎn)移灶(Micrometastasis formation)等。
其中細胞侵襲發(fā)生在第一步,即腫瘤細胞在原位突破基底膜,然后內(nèi)滲進入血管、淋巴管的過程。其侵襲性是腫瘤相關(guān)信號通路、藥物治療、靶向治療、致癌/抑癌基因等腫瘤學(xué)研究的一個重要指標。
(腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程,來源DOI:10.1016/j.cell.2011.09.024)
腫瘤細胞侵襲實驗通常利用細胞小室(常用6孔、12孔、24孔板等)進行檢測。
與腫瘤細胞遷移實驗不同的是,需在聚碳酸酯膜上側(cè)鋪一層基質(zhì)膠,用以模仿細胞外基質(zhì)。
腫瘤細胞必須分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)消化基質(zhì)才能進入下室,更好的模擬了動物體內(nèi)的情況。
侵襲實驗過程
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a. 基質(zhì)膠包被:
(a) 將基質(zhì)膠置于冰中并在4℃融化,使用預(yù)冷的移液管或吸頭混合基質(zhì)膠至均勻狀態(tài)。(b) 在冰上,將基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)液按照1:8的比例進行稀釋,例如取8μl基質(zhì)膠加入64μl不含血清的培養(yǎng)液中,使用預(yù)冷的吸頭混合至均勻狀態(tài)。
注:常用的稀釋比例為1:4、1:6、1:8,可根據(jù)實驗具體情況調(diào)整稀釋比例。(c) 取60μL上述混合溶液垂直加入細胞小室中,使其均勻平鋪在底部。
(d) 吸出未結(jié)合的基質(zhì)膠。
(e) 加入100μl不含血清的培養(yǎng)液,將培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)箱孵育30分鐘,進行水化。(f) 去除小室中液體,檢查是否有液體穿過小室進入到下室中,若沒有,則可用于接種細胞。
b. 細胞懸液的制備:(a) 對細胞進行12-24小時的饑餓處理。(非必需步驟)(b) 消化細胞,用不含血清的培養(yǎng)液重懸,調(diào)整細胞密度為5-50萬個/mL。
c. 細胞接種:(a) 取500μL含10% FBS的培養(yǎng)液加入24孔板下室,用鑷子將細胞小室置于24孔板內(nèi)。
(b) 取200μL細胞懸液加入細胞小室。(c) 將24孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時。
d. 細胞固定、染色:(a) 取出細胞小室,去除培養(yǎng)液,用棉簽輕輕擦拭基質(zhì)膠及細胞。(b) 在24孔板干凈的孔中加入600μl 4%多聚甲醛固定液,將小室放入固定20-30分鐘。(c) 棄固定液,PBS洗滌小室1次。
(d) 在24孔板干凈的孔中加入適量結(jié)晶紫染色液,將小室放入染色5-10分鐘。(e) 取出小室,PBS洗滌3次。
(f) 適當(dāng)風(fēng)干后,顯微鏡下觀察并計數(shù)。
除細胞侵襲實驗外,基質(zhì)膠可被用于類器官培養(yǎng)、干細胞分化、血管生成、體內(nèi)腫瘤發(fā)生等多項研究。